Progetto di ricerca: Studi preclinici di nuove strategie contro il carcinoma mammario
Assegnista: Dott. Massimiliano Dall'Ora
Tutor: Prof. Pier-Luigi Lollini
Periodo: 1/3/16-28/2/17
Sede: Laboratorio di Immunologia e Biologia delle Metastasi, Sede di Cancerologia, Centro
interdipartimentale di ricerche sul cancro "Giorgio Prodi".
L'attività di ricerca aveva tre obiettivi: 1) lo studio della progressione tumorale del carcinoma mammario HER-2 positivo, in cui molto spesso viene riscontrata la coespressione della forma full-length di HER2 e di sue varianti, tra cui un'isoforma derivante da splicing alternativo (Delta16); 2)la valutazione di diverse terapie mirate anti-HER2 rispetto all'insorgenza di varianti HER2-negative; 3) lo studio di tumori mammari HER2-positivi mantenuti in vivo come xenotrapianti in topi immunodeficienti.
1) Studio della progressione tumorale in topi transgenici per diverse isoforme di HER2
La cancerogenesi mammaria spontanea dei topi FI (HER2+D16+) è stata confrontata con quella dei topi transgenici parentali esprimenti una sola delle due forme (indicati come topi HER2 e topi DI6). Tutti i topi portatori della variante di splicing (i topi D16 e i topi FI) hanno mostrato una significativa anticipazione dell'insorgenza tumorale (latenza mediana di 17 settimane) rispetto ai topi portatori della sola forma full-lenght (latenza mediana di 47 settimane). La maggiore aggressività conferita dall'espressione della variante D16 è stata confermata anche analizzando il numero medio di tumori per topo (molteplicità), infatti i topi FI e D16 mostravano un simile andamento della molteplicità e, invece, un aumento significativo rispetto ai topi HER2. Tuttavia i tumori insorti nei due modelli FI e DI6 sono cresciuti molto più lentamente rispetto a quelli insorti nei topi HER2 e in termini di capacità metastatica spontanea ai polmoni non è stata riscontrata alcuna significativa differenza tra i tre ceppi. Questi dati suggeriscono che la presenza della forma di splicing D16 possa avere un ruolo dominante nelle fasi precoci della trasformazione tumorale rispetto alla forma full-lenght, ma non sembra invece incidere nelle fasi più tardive della progressione tumorale. Mediante analisi con Real-Time PCR, utilizzando primer specifici per le due isoforme, è stata analizzata l'espressione differenziale tra HER2 e DI6 nei tumori insorti nei topi FI, in cui è stato evidenziato che la maggior parte dei tumori esprimevano principalmente DI6, alcuni entrambe le isoforme, alcuni solo HER2. Da questi tumori sono state ottenute delle linee cellulari rappresentative di questi tre gradi di espressione delle due isoforme per poter valutare la sensibilità in vitro in 3D, in condizioni di crescita ancoraggio-indipendente, a farmaci anti-HER2. L'alta espressione di Deltaló è stata associata ad un'alta sensibilità a terapie anti-HER2 quali trastuzumab, neratinib e lapatinib. Inoltre, nel corso di quest'anno di progetto sono stati effettuati studi sull'efficacia del trastuzumab in topi FI. Da questi si è evinto che il trastuzumab previene in maniera efficace l'insorgenza tumorale infatti circa l'85% dei topi erano liberi da tumore ad un anno di età dell'animale. Inoltre l'effetto del trastuzumab è risultato più potente nei topi FI che nei topi parentali.
2) Perdita di HER2 e sensibilità alle terapie.
Circa il 70% delle pazienti con carcinoma mammario HER2-positivo in seguito a trattamento con trastuzumab o lapatinib sviluppano resistenza a tali trattamenti. Inoltre in circa il 25% dei pazienti con tumore HER2- positivo si assiste ad una progressione tumorale che porta allo sviluppo dimetastasi HER2-negative associate ad una diminuzione della sopravvivenza. La perdita di espressione di HER2 è un fenomeno che è stato riscontrato nel modello murino HER2, per cui è stato messo appunto un sistema dinamico di linee cellulari che possono presentare 1) una alta e stabile espressione di HER2 in vivo e in vitro (linea HER2stable), 2) una alta ma labile espressione di HER2 che può essere persa in vitro spontaneamente o in seguito a trattamento con Trastuzumab o dopo crescita in vivo (linea HER21abile) e 3) completa perdita di espressione di HER2 (linea HER21oss). Su queste linee cellulari è stato valutato un nuovo inibitore della PI3K, il GNE-317 (Genentech), che dopo 72h di trattamento ad un dosaggio compreso fra 10-1 uM-1 uM si è dimostrato in grado di ridurre la crescita in vitro delle tre linee del 50% . Lo studio del farmaco è stato quindi esteso al modello in vivo dove il GNE-317 ha ridotto quasi completamente la crescita sottocutanea del tumore sia per i tumori derivanti dalla linea cellulare HER-21abile (veicolo 1.395±0.132 cm 3 rispetto a GNE-317 0.037±0.021 cm3 , 37 giorni dopo l'inoculo delle cellule) che per i tumori derivati dalla linea cellulare HER-21oss (veicolo 1.789±0.195 cm3 e GNE-317 0.226±0.056 cm3, 19 dopo l'inoculo delle cellule).
3) Studio del carcinoma mammario HER2 -positivo in Patient-Derived Xenografts (PDX).
Con l'obiettivo di ottenere una raccolta di modelli di xenotrapianti di tumore mammario derivati da paziente (PDX), un totale di 65 campioni a fresco di carcinomi mammari ottenuti mediante resezione chirurgica sono stati impiantati in area mammaria in topi immunodepressi, BALB/c Rag2-/-;I12rg-/- (RGKO) oppure NOD-SCID-LOrg' 7 ' (NSG), in corso di anestesia totale. Considerando il totale dei prelievi inoculati, la percentuale di attecchimento, intesa come il numero di prelievi cresciuti al primo impianto, è risultata essere del 9%. I sottotipi HER2 -positivo e triplo negativo, entrambi negativi per i recettori ormonali, sono quelli che hanno dato maggiori percentuali di attecchimento (40-20%), mentre luminale A, luminale B e HER2 triplo positivo hanno raggiunto percentuali di attecchimento inferiori al 15%. Al momento del sacrificio dell'animale, il tumore veniva impiantato nuovamente in un altro ospite e in questo modo è stato possibile osservare che il 60% dei prelievi attecchiti (6 prelievi su 10) era in grado 'di dar luogo a passaggi successivi, iniziando così la propagazione del tumore in vivo. La nostra attenzione si è quindi incentrata su di un PDX HER2 positivo, denominato FO-4, ad oggi arrivato all'undicesimo passaggio in vivo. I livelli di espressione genica delle isoforme Deltaló e HER2 full length si mantengono costanti nel corso dei passaggi successivi in vivo, dal momento che il confronto statistico delle medie di espressione non mostra alcuna differenza significativa. I dati di citofiuorimetria evidenziano elevati livelli di espressione di HER2 in membrana, con un lieve calo all'aumentare dei passaggi in vivo, nel complesso tuttavia l'espressione proteica di HER2 si può considerare costante attraverso i passaggi. Anche in western bot i dati evidenziano una stabilità nel corso dei passaggi in vivo dell'espressione della proteina HER2 totale. Allo stesso modo i livelli di espressione della proteina fosforilata, seppur oscillanti, indicano il mantenimento della segnalazione mediata da HER2 anche a passaggi più tardivi.
Dott. Massimiliano Dall'Ora
II sottoscritto Prof. PIER-LUIGI LOLLINI, tutor del Dott. MASSIMILIANO DALL'ORA, esprime parere positivo sull'attività di ricerca svolta dal Dott. Dall'Ora nell'ambito del progetto di ricerca affidatogli.
Prof. Pier-Luigi Lollini